使用AmpliScribe™高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒可
能zui高產(chǎn)量的持續(xù)制備RNA

Judith T. Schanke, EPICENTRE Technologies

介紹：
      使用嗜菌體RNA多聚酶體外轉(zhuǎn)錄DNA模板是普遍使用的產(chǎn)生特異RNA轉(zhuǎn)錄本的有效方法。嗜菌體RNA多聚酶從特異的嗜菌體啟動(dòng)子控制下的克隆的線性DNA模板合成RNA。體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA廣泛地用于包括體外翻譯，核酶合成1，剪切及加工研究，結(jié)構(gòu)鑒定以及制備非放射性RNA探針2-4。通過轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄本還可以以顯微注射的方式導(dǎo)入細(xì)胞5進(jìn)行反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，或用于RNA的細(xì)胞定位4。
      EPICETRE公司的AmpliScribeäT7，T3和SP6高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒使用高濃度的NTPs（抑制其它試劑盒和其它傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)），能zui大可能地產(chǎn)生大小范圍從25堿基到數(shù)千堿基的RNA轉(zhuǎn)錄本6。使用AmpliScribeT7RNA轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以從每微克DNA模板產(chǎn)生多至150微克的高質(zhì)量，全長(zhǎng)（1.4kb）的RNA轉(zhuǎn)錄本。在此，從體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品的產(chǎn)量或及RNA的完整性兩方面，將AmpliScribeT7轉(zhuǎn)錄試劑盒與傳統(tǒng)的T7RNA多聚酶轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系7及另兩個(gè)供應(yīng)商的類似試劑盒相比較。
 

材料與方法：

• DNA模板的制備
      線性DNA模板以限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒DNA產(chǎn)生。消化后的DNA以200µg/ml蛋白酶K和0.5%SDS，50°C處理30分鐘zui大限度地減少核酸酶污染。酚/氯仿法抽提后乙醇沉淀純化質(zhì)粒，再以TE重懸。AmpliScribe線性對(duì)照DNA由試劑盒提供。
• 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
      AmpliScribeT7轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按試劑盒提供的方法進(jìn)行。20µl反應(yīng)體系中含1×反應(yīng)緩沖液，10mM DTT，7.5mM NTPs，1µg線性DNA模板，2µl AmpliScribeT7酶溶液，37°C反應(yīng)2小時(shí)。用其它廠商試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)按試劑盒提供的方法進(jìn)行。每20µl反應(yīng)體系中含1µg線性DNA模板，37°C反應(yīng)2小時(shí)。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系含10UT7 RNA多聚酶，0.5mM NTPs，1×轉(zhuǎn)錄緩沖液及10mM DTT7。
• RNA定量和完整性分析
      加入等體積冷5M醋酸銨終止轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，樣品冰上放置10分鐘，zui大速度離心10分鐘沉淀RNA。光譜測(cè)定法定量，使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行非變性瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整性。

結(jié)果與討論：
      與傳統(tǒng)方法相比，AmpliScribe高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒能產(chǎn)生20倍以上的RNA。使用AmpliScribeT7高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒和傳統(tǒng)T7RNA多聚酶反應(yīng)定時(shí)轉(zhuǎn)錄以制備1.4kb的轉(zhuǎn)錄本。37°C反應(yīng)2小時(shí)，醋酸銨沉淀法終止反應(yīng)。光譜分析測(cè)定RNA產(chǎn)量。使用AmpliScribeT7轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以較傳統(tǒng)反應(yīng)多產(chǎn)生20被以上的全長(zhǎng)RNA轉(zhuǎn)錄本。

• AmpliScribeT7高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒持續(xù)地產(chǎn)生zui大產(chǎn)量的RNA。
      比較AmpliScribeT7高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒和另兩個(gè)供應(yīng)商的高產(chǎn)量試劑盒以生產(chǎn)商推薦的方法對(duì)從63堿基到2.6kb長(zhǎng)度的三個(gè)線性DNA模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)2小時(shí)。AmpliScribeT7試劑盒較另兩個(gè)高產(chǎn)量試劑盒持續(xù)產(chǎn)生更多的轉(zhuǎn)錄本。
• AmpliScribeT7高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒有更高的短RNA（<300堿基）產(chǎn)生
      產(chǎn)生大量的短RNA轉(zhuǎn)錄本較標(biāo)準(zhǔn)模板要有更多的起始事件。使用AmpliScribeT7高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒能較另兩個(gè)供應(yīng)商A和P的試劑盒產(chǎn)生更多的短轉(zhuǎn)錄本。供應(yīng)商A的T7轉(zhuǎn)錄試劑盒也是特為產(chǎn)生短RNA（<300堿基）的。為了與此“段轉(zhuǎn)錄”試劑盒進(jìn)行比較，進(jìn)行了比較反應(yīng)。
   

    結(jié)果表明AmpliScribe試劑盒能較供應(yīng)商A的短模板轉(zhuǎn)錄試劑盒產(chǎn)生更多的63堿基轉(zhuǎn)錄本。以標(biāo)準(zhǔn)2小時(shí)反應(yīng)，AmpliScribe轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生的RNA是其它系統(tǒng)的兩倍、延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至6小時(shí)，產(chǎn)生的RNA量則為供應(yīng)商A的試劑盒產(chǎn)量的4倍之多。盡管產(chǎn)生的段RNA微克數(shù)較1kb以上的RNA量少，但短RNA的分子數(shù)則大于1kb以上的RNA。反應(yīng)6小時(shí)后可以觀察到A供應(yīng)商的試劑盒產(chǎn)生的RNA有降解現(xiàn)象，而AmpliScribe試劑盒可以持續(xù)增加全長(zhǎng)RNA轉(zhuǎn)錄本。

• AmpliScribeT7高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒產(chǎn)生完整性好的RNA
      理想的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)應(yīng)該產(chǎn)生全長(zhǎng)的完整RNA轉(zhuǎn)錄本。為了比較產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄本的完整性，AmpliScribeT7試劑盒與另兩個(gè)供應(yīng)商A和P的高產(chǎn)量試劑盒產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行了瓊脂糖凝膠電泳分析。所有被測(cè)的試劑盒均產(chǎn)生高質(zhì)量，全長(zhǎng)的1.8kbRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在時(shí)間曲線實(shí)驗(yàn)中，AmpliScribeT7試劑盒產(chǎn)生的1.4kb轉(zhuǎn)錄本的完整性在2，4，6小時(shí)時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行檢測(cè)，證明在所有時(shí)間點(diǎn)均產(chǎn)生高質(zhì)量的全長(zhǎng)RNA。

總結(jié)：
    AmpliScribeT7高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒持續(xù)性產(chǎn)生的RNA產(chǎn)量可能是當(dāng)前已有體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中產(chǎn)量zui高的。它能地以廣域的DNA為模板，重復(fù)性合成大量的全長(zhǎng)RNA。

參考文獻(xiàn)：
1. Hoffman, L. and Johnson, M. （1994） BioTechniques 17, 372.
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7. Melton, D. Et al. （1984） Nucl. Acids Res. 12, 7035.