膠原蛋白的分析

新鮮、冷凍和福爾馬林固定的組織

介紹

從組織中提取膠原的效率較低且可變，可能是由于成熟膠原中存在交聯(lián)。因此，定量分析膠原蛋白的

一種常用方法是對(duì)組織進(jìn)行酸水解，然后用HPLC或比色法測(cè)定羥脯氨酸。該方法適用于組織和組織提取物。

然而，組織儲(chǔ)存的主要方式是作為石蠟包埋的福爾馬林固定組織。到目前為止，組織學(xué)染色和圖像分析是分析石蠟包埋組織的方法。這種方法確實(shí)提供了關(guān)于組織中膠原蛋白定位的定性信息，但只是半定量的。

我們?cè)O(shè)計(jì)了一種定量和易于分析福爾馬林固定石蠟包埋的組織或組織切片中的膠原蛋白的方法。不需要用二甲苯等有毒溶劑去除石蠟，也不需要使用特殊設(shè)備。該方法的靈敏度是，僅適用于少量10µm組織切片定量膠原。

在這個(gè)應(yīng)用說(shuō)明中，我們展示了在新鮮或冷凍組織、福爾馬林固定組織和石蠟包埋組織中易于進(jìn)行每個(gè)蛋白分析的數(shù)據(jù)和方法。

圖1.

不同類型組織中總膠原和總蛋白分析示意圖

方法

.1該程序的表示形式如圖所示。將5-10個(gè)10µm組織切片（或相應(yīng)數(shù)量的新鮮或福爾馬林固定組織）轉(zhuǎn)移到薩斯特管中，加入150µl6M鹽酸，在95時(shí)通過o/n孵育水解oC在熱塊中。

水解后，在不進(jìn)行任何預(yù)處理的情況下，35µl用于膠原定量測(cè)定(測(cè)定時(shí)間90min)， 15µl用于快速酶蛋白測(cè)定(測(cè)定時(shí)間30min)，這是專門用于酸水解物中的蛋白質(zhì)分析的方法開發(fā)的。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)被用作用于水解的未知數(shù)量的組織的歸一化。結(jié)果在冷凍組織、石蠟化和脫親和的組織切片中，膠原蛋白和蛋白質(zhì)的比例相似樣品處理，如甲醛固定、石蠟包埋和二甲苯處理脫除樣品，不影響膠原蛋白和蛋白質(zhì)分析（圖2）。

圖2.

以不同方式處理的組織中的膠原蛋白/蛋白質(zhì)比例 在甲醛固定石蠟包埋的人動(dòng)脈組織中分析膠原蛋白。將冷凍組織、10µm石蠟包埋組織切片或10個(gè)經(jīng)二甲苯預(yù)處理的10µm組織切片 水解，并使用快速酶總膠原試驗(yàn)和快速酶蛋白試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步分析

每個(gè)蛋白質(zhì)的膠原蛋白的結(jié)果與每個(gè)濕重分析的膠原蛋白相似

每毫克組織濕重的膠原蛋白和每毫克蛋白質(zhì)的膠原蛋白給出了類似的結(jié)果(見表1A和表1B)。因?yàn)椴⒉皇轻槍?duì)所有的應(yīng)用程序(例如。當(dāng)使用福爾馬林固定的組織時(shí))，可以確定濕重或干重，酸水解酸中的蛋白質(zhì)分析為組織中的膠原蛋白分析提供了新的機(jī)會(huì)。

表1A。不同小鼠組織的每濕重膠原蛋白分析機(jī)構(gòu)

表1B。不同小鼠組織的膠原蛋白分析

從不同類型的（纖維化）組織的切片中提取的膠原蛋白和蛋白質(zhì)分析從組織切片開始，例如小鼠腎纖維化(UUO)、肺纖維化（博萊霉素誘導(dǎo)）和肝纖維化(NASH)。從10個(gè)10µm石蠟包埋切片中測(cè)定總膠原蛋白/總蛋白。3)，并被發(fā)

現(xiàn)在纖維化條件下增加。

圖3在各種纖維化和非纖維化組織中處理的組織中的膠原/蛋白比例

在小鼠腎纖維化(UUOvsSham)肺纖維化(博萊霉素vsPBS)和飲食誘導(dǎo)的NASH(西 方飲食加膽固醇vs對(duì)照組)的甲醛固定石蠟包埋組織中分析總膠原蛋白/總蛋白。對(duì)10個(gè)10µm組織切片進(jìn)行水解，并使用快速酶總膠原分析和蛋白分析

結(jié)論

在新鮮、冷凍或福爾馬林固定石蠟包埋組織中，膠原蛋白和總蛋白的定量現(xiàn)在可以以一種快速和簡(jiǎn)單的檢測(cè)格式進(jìn)行，而不需要HPLC或其他特殊設(shè)備。QuickZyme生物科學(xué)公司開發(fā)了一套用于分析任何物種的膠原蛋白的分析方法，每一種都有不同的應(yīng)用領(lǐng)域膠原蛋白 相關(guān)的 化驗(yàn) 可用的 在 激酶 生物科學(xué)激酶可溶性膠原蛋白測(cè)定

快速Zyme總膠原檢測(cè)

激酶羥脯氨酸測(cè)定

快速zyme蛋白測(cè)定

激酶可溶性膠原蛋白測(cè)定

該檢測(cè)方法可識(shí)別可溶性或（酸/胃蛋白酶）可溶性膠原蛋白。

該檢測(cè)方法是比色法，有96孔板格式，并基于膠原蛋白與天狼星紅的沉淀。這種染料可以結(jié)合堿性氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)。染料在高pH下從沉淀配合物中釋放，然后進(jìn)行比色檢測(cè)。基于天狼星紅的檢測(cè)可以識(shí)別膠原蛋白，但也有其他一些基質(zhì)相關(guān)蛋白可能共同沉淀。

應(yīng)用：該測(cè)定方法用于測(cè)定（可溶性）膠原蛋白。細(xì)胞培養(yǎng)基，以及（酸或酸/胃蛋白酶）溶解的膠原蛋白e。g.從 細(xì)胞提取物。

quickzyme 總膠原檢測(cè)

該方法可識(shí)別所有類型的膠原蛋白，無(wú)論其形式如何（成熟、未成熟、前膠原蛋白、降解膠原蛋白、交聯(lián)膠原蛋白、來(lái)自不同來(lái)源的膠原蛋白）。

該檢測(cè)方法是比色法，具有96孔板格式，并基于羥脯氨酸的定量，這是一種只存在于膠原蛋白中的氨基酸。羥脯安酸在含膠原樣品的酸水解后釋放出來(lái)。水解在95點(diǎn)進(jìn)行0C，該產(chǎn)品可直接用于羥脯氨酸分析，無(wú)需進(jìn)步洗滌或干燥步驟。該分析是基于已建立的氯胺T/DMBA方法。

應(yīng)用范圍：該測(cè)定方法用于測(cè)定總膠原蛋白。由于一是樣品的*水解，膠原蛋白的提取困難沒有任何作 用。該檢測(cè)方法適用于所有類型的樣本，包括組織。

激酶羥脯安酸測(cè)定

該測(cè)定方法與總膠原測(cè)定方法相似，不同之處在于沒有包括膠原水解的方案和材料，而沒有提供膠原標(biāo)準(zhǔn)

，而是羥脯安酸標(biāo)準(zhǔn)。

應(yīng)用：該方法與總膠原檢測(cè)具有相同的應(yīng)用區(qū)域，但適用于有自己的水解方法或有水解樣品進(jìn)行分析的客戶。

quickzyme蛋白測(cè)定

該方法測(cè)定蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的游離氨基酸。該方法采用比色法，可直接對(duì)酸水解物進(jìn)行。

應(yīng)用：該方法旨在測(cè)量酸水解物中的總蛋白，當(dāng)不可能進(jìn)行基于重量的歸一化、不方便或變化太大時(shí)，提供總 膠原蛋白和羥脯安酸值的歸一化。