線性PEI轉(zhuǎn)染說明書

PEI轉(zhuǎn)染注意要點  

化學(xué)名：線性聚乙烯亞胺，線性PEI，聚乙烯亞胺，線性，MW 25000，轉(zhuǎn)染級

訂貨號＃：  9002-98-6   規(guī)格：1G  品牌：BIOHUB      CAS＃： 9002-98-6,26913-06-4        

分子式：（CH2CH2NH）n      分子量： 25,000      熔點： 73-75o

溶于：熱水，低pH冷水，甲醇和乙醇。    不溶于：苯，乙酉迷和丙酮  

外觀：白色至黃色固體       處理：手套和通風(fēng)櫥

儲存：在室溫下避光干燥儲存

配置：1：稱取100mg線性聚乙烯亞胺，加新鮮的細胞級別的水90ml，加鹽酸至PH=3左右， 加熱至80℃左右攪拌過夜溶解PEI，

2：用*溶液調(diào)整pH值至7.0 ，定容至100ml，用0.22um的濾器過濾，分裝后儲存于4℃，保質(zhì)期可以達到12個月。

轉(zhuǎn)染操作流程：

◆ 瞬時轉(zhuǎn)染方法

1. 接種細胞： 轉(zhuǎn)染前一天，用膠原酶（WORTHINGTONG公司LS004196)消化細胞并計數(shù)（不建議用胰酶）。調(diào)整細胞濃度，將細胞鋪入細胞培養(yǎng)的器皿，每個孔置入的細胞量應(yīng)能使轉(zhuǎn)染時細胞匯合度達到 70~80%。

2. 準(zhǔn)備 DNA-PEI 復(fù)合物： DNA、PEI 試劑和稀釋劑在進行以下步驟前需先使其升至室溫。，用 Opti-MEM ITM（Invitrogen）或其他適合的無蛋白培養(yǎng)基稀釋適量 DNA。用同樣的培養(yǎng)基稀釋 PEI 試劑。每 1 μg DNA 需用 1-5 μL 線性PEI轉(zhuǎn)染試劑。一邊輕輕渦旋裝有 DNA 溶液 的試管，一邊將稀釋的線性PEI轉(zhuǎn)染試劑滴加至試管中（注意：請勿顛倒添加順序）。充分混勻后，室溫靜置 10~25 min 以形成 DNA-PEI復(fù)合物。當(dāng)溶液體積較大時，請用圓底聚丙烯管，例如 NEST  5 mL /14 mL 離心管。

3. 轉(zhuǎn)染細胞： 直接向每個孔中加入 DNA-PEI復(fù)合物并輕輕渦旋培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿。在無血清條件下轉(zhuǎn)染時，去除生長培養(yǎng)基，替換成無血清培養(yǎng)基，然后滴DNA-PEI復(fù)合物。轉(zhuǎn)染 3 h 后，添加?體積的包含 30%血清的生長培養(yǎng)基。

4. 孵育細胞和分析結(jié)果： 在 CO2培養(yǎng)箱中 37℃下孵育細胞至可以分析檢測。轉(zhuǎn)染后快 7 h 即可檢測到轉(zhuǎn)入基因的表達。 請自行確定適合檢測時間。

◆穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法

1. 接種細胞： 轉(zhuǎn)染前一天，用膠原酶（WORTHINGTONG公司LS004196)消化細胞并計數(shù)（不建議用胰酶）。調(diào)整細胞濃度，將細胞鋪入細胞培養(yǎng)的器皿，每個孔置入的細胞量應(yīng)能使轉(zhuǎn)染時細胞匯合度達到 70~80%。

2. 準(zhǔn)備 DNA-PEI 復(fù)合物： DNA、PEI 試劑和稀釋劑在進行以下步驟前需先使其升至室溫。依據(jù)表 1 所示，用 Opti-MEM ITM（Invitrogen）或其他適合的無蛋白培養(yǎng)基稀釋適量 DNA。用同樣的培養(yǎng)基稀釋 PEI 試劑。每 1 μg DNA 需用 1-5 μL 線性PEI轉(zhuǎn)染試劑(這個需要客戶自行摸索配比，每一批轉(zhuǎn)染試劑和每一批DNA比例可能會稍有不同）。一邊輕輕渦旋裝有 DNA 溶液的試管，一邊將稀釋的線性PEI轉(zhuǎn)染試劑滴加至試管中（注意：請勿顛倒添加順序）。充分混勻后，室溫靜置 10~25 min 以形成 DNA-PEI復(fù)合物。當(dāng)溶液體積較大時，請用圓底聚丙烯管，例如 NEST  5 mL /14 mL 離心管。

3. 轉(zhuǎn)染細胞： 直接向每個孔中加入 DNA-PEI復(fù)合物并輕輕渦旋培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿。在無血清條件下轉(zhuǎn)染時，去除生長培養(yǎng)基，替換成無血清培養(yǎng)基，然后滴DNA-PEI復(fù)合物。轉(zhuǎn)染 3 h 后，添加?體積的包含 30%血清的生長培養(yǎng)基。

4. 孵育細胞和分析結(jié)果： 在 CO2培養(yǎng)箱中 37℃下孵育細胞至可以分析檢測。轉(zhuǎn)染后 7 h 即可檢測到轉(zhuǎn)入基因的表達。

5.轉(zhuǎn)染 24 h 后，將細胞傳代至新鮮的生長培養(yǎng)基中（將細胞稀釋 10 倍 以上），在 CO2培養(yǎng)箱中 37℃孵育過夜。第二天加入與轉(zhuǎn)染抗性基因相匹配的篩選藥物。約 1~2 周可 篩選到耐藥性克隆，在這期間需經(jīng)常更換含篩選藥物的生長培養(yǎng)基。 ?

特別提醒

1. PEI 25K含有4-11％的殘留丙酰基，這可能阻礙聚合物主鏈與DNA的有效結(jié)合，所以批間轉(zhuǎn)染效率可能會有比較大的差異，建議一個批次可以多購買，PEI 25K穩(wěn)定性在室溫干燥避光下可穩(wěn)定保存10年以上（雖然有效期標(biāo)注只有18個月左右）

2. 對于某些類型的細胞如 HEK-293、HEK293T、NIH/3T3 和 COS 細胞，在轉(zhuǎn)染前兩天鋪板可顯著 提高轉(zhuǎn)入基因的表達水平。如果選擇轉(zhuǎn)染前兩天鋪板，可適當(dāng)降低鋪板密度，以確保轉(zhuǎn)染時細胞的匯合度仍為 70~80%。

3. 對于接觸抑制敏感的細胞，可適當(dāng)降低鋪板密度。

4. 即使在有蛋白（如 10%的血清）存在的情況下，DNA-PEI復(fù)合物仍能轉(zhuǎn)染細胞，但是 DNA-PEI復(fù)合物必須在無蛋白存在的條件下形成。我們推薦使用 Opti-MEM ITM 培養(yǎng)基以達到宜轉(zhuǎn)染效率。其他的無蛋白培養(yǎng)基則需測試與線性PEI轉(zhuǎn)染試劑的兼容性。

5. 對大多數(shù)細胞來而言，每 1 μg DNA 使用 3.0 μL PEI轉(zhuǎn)染試劑都能獲得較高轉(zhuǎn)染效率。使用 者也可嘗試每 1 μg DNA 使用 1~4 μL 體積線性PEI轉(zhuǎn)染試劑進行優(yōu)化。

6.本手冊只是一個基本操作手冊，具體轉(zhuǎn)染過程中需要根據(jù)實驗進行優(yōu)化，優(yōu)化方向為混合時間，轉(zhuǎn)染時間，DNA混合比列.......

7.Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) 為Polysciences公司生產(chǎn)的化合物產(chǎn)品，每批產(chǎn)品出廠前都經(jīng)過嚴格的檢測,保證每批產(chǎn)品都*、穩(wěn)定且高品質(zhì),但由于作為轉(zhuǎn)染試劑使用過程中有很多實驗室因素(配置方法，PH,水純度,稱量的準(zhǔn)度,dna RNA純度,細胞狀態(tài)，細胞品系…)造成溶解出現(xiàn)問題或者轉(zhuǎn)染效率出現(xiàn)差異,所以廠家只受理該產(chǎn)品純度，分子量及重量缺失破損等相關(guān)投訴，針對極個別客戶溶解問題和轉(zhuǎn)染效率問題我們只能友善解決,所以不能保證您能獲得滿意答復(fù)，對于產(chǎn)品產(chǎn)品轉(zhuǎn)染效率不高，轉(zhuǎn)染批間有差異，轉(zhuǎn)染不了等問題，不作為評價我們售后工作的依據(jù)。
   如果我們提供的PEI手冊都無法解答您的問題,建議您可以多看文獻,多調(diào)整一下轉(zhuǎn)染條件,找出適合自己細胞的轉(zhuǎn)染方法。如果無暇摸索條件,您也可以直接購買我們配置好細胞轉(zhuǎn)染液,這樣免去您很多煩惱,謝謝理解

8.部分數(shù)據(jù)參考，本數(shù)據(jù)來源于網(wǎng)絡(luò)，不作為售后投訴依據(jù)

轉(zhuǎn)染試劑和DNA配比數(shù)據(jù)

轉(zhuǎn)染效率